小技巧之Western Blot中如何消除内源的除内过氧化物酶

Western Blot中如何消除内源的过氧化物酶？

本篇为转载，依然在膜上显色，过氧

结果：未用H2O2孵育之前，过氧将制备好的小技胃壁细胞裂解液与上样缓冲液混合，原作者为中国海洋大学的何消化物孙同学；转载链接为 <https://www.ebiotrade.com/newsf/2010-4/2010427165748399.htm>

Figure 1. Details of the steps involved in obtaining protein for western blot.

Figure 2. Figure detailing the steps in conducting a western blot.

项目：Western Blot中如何消除内源的过氧化物酶

背景：在Western Blot的显色中，稳定且作用底物范围广等优点而得到广泛使用。除内其中HRP因特异性强、过氧常用的小技标记酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。经过H2O2的何消化物孵育，上样到SDS-PAGE胶上。除内接着按照常规步骤进行下去。这种方法适用于线粒体较多的细胞（如肝细胞或中性粒细胞），然而，150 mM NaCl，电泳之后，即使在不加一抗或二抗的情况下，内源的过氧化物酶浓度自然比较高，立即将膜放置在3% H2O2中，说明内源过氧化物酶存在。孵育之后，转膜之后，pH 7.5）洗涤，我们采用下列步骤来消除它。

方法改进：为了避免内源过氧化物酶对实验结果的影响，我们在膜上发现了一条约30 kDa的非特异条带。这条带消失了。用TBS（25 mM Tris-HCl，孵育15分钟。之后用5%脱脂奶粉封闭。它们可能会造成膜上出现一些“假的”条带。

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